{"id":530,"date":"2020-12-17T20:50:13","date_gmt":"2020-12-17T19:50:13","guid":{"rendered":"http:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/?p=530"},"modified":"2020-12-28T12:10:18","modified_gmt":"2020-12-28T11:10:18","slug":"las-vacunas-de-arn-una-nueva-forma-de-generar-inmunidad-contra-sars-cov-2","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/?p=530","title":{"rendered":"Las vacunas de ARNm, una nueva forma de generar inmunidad contra SARS-CoV-2"},"content":{"rendered":"\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><strong>1.- Introducci\u00f3n<\/strong><br>La vacunaci\u00f3n es el mejor m\u00e9todo para la prevenci\u00f3n y el control de enfermedades infecciosas. El desarrollo de muchas vacunas ha salvado miles de vidas y ha ahorrado grandes cantidades de dinero a los sistemas de salud y como estamos viendo en el caso de COVID-19, el impacto sobre la salud y la econom\u00eda global ser\u00e1 brutal. Los inmun\u00f3logos junto con los epidemi\u00f3logos somos los profesionales que debemos conocer el mecanismo de acci\u00f3n que genere de forma segura inmunidad y analizar el impacto de las vacunas en la sociedad.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Conseguir una vacuna eficaz y r\u00e1pida ante una pandemia por un virus emergente requiere dos puntos cruciales:<\/p>\n\n\n\n<ul class=\"wp-block-list\"><li>En primer lugar, precisi\u00f3n y efectividad en el dise\u00f1o de ant\u00edgeno viral.<\/li><li>Y en segundo lugar una plataforma de fabricaci\u00f3n que sea capaz de acortar el tiempo de disponibilidad del producto en el mercado.<\/li><\/ul>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Las vacunas basadas en subunidades de prote\u00ednas y producidas en l\u00edneas celulares suelen tardar m\u00e1s de un a\u00f1o en generarse. Por el contrario, la fabricaci\u00f3n de vacunas de \u00e1cido nucleico (ADN y ARN mensajero, ARNm) se pueden lograr en cuesti\u00f3n de semanas. Por eso, y poco menos de un a\u00f1o desde que se desatase la pandemia zoon\u00f3tica, seis pa\u00edses, Reino Unido, Canad\u00e1, Arabia Saudita, Bahr\u00e9in, EE. UU. y M\u00e9xico ya han dado su aprobaci\u00f3n a la vacuna de Pfizer-BioNTech. Y se espera un curso similar para la vacuna de Moderna en los pr\u00f3ximos d\u00edas. Dos vacunas de ARNm.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"672\" height=\"557\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/BBC.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-538\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/BBC.png 672w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/BBC-300x249.png 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/BBC-600x497.png 600w\" sizes=\"auto, (max-width: 672px) 100vw, 672px\" \/><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">La aprobaci\u00f3n de una vacuna de ARNm para el coronavirus significa, por un lado, la autorizaci\u00f3n de la primera de su tipo contra enfermedades infecciosas. Y por otro lado una revoluci\u00f3n en el concepto que ten\u00edamos hasta ahora de dise\u00f1ar y elaborar vacunas. Estas, hasta la fecha actuaban inyectando el pat\u00f3geno o parte de \u00e9l para que pudiera entrenar al sistema inmunitario para reconocerlo y responder a las prote\u00ednas producidas por el mismo microorganismo. Pero, por el contrario, las vacunas de ARNm usan al propio organismo para producir de forma segura algunas de las prote\u00ednas virales para inducir esa respuesta inmunitaria contra el pat\u00f3geno.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Si nos centramos el agenta causal de la COVID-19, la prote\u00edna S del SARS-CoV-2 es un polip\u00e9ptido transmembranario de tipo I con un ectodominio grande y un endodominio corto. Estructuralmente esta prote\u00edna S est\u00e1 compuesta por dos subunidades funcionales, S1 (bulb) para uni\u00f3n al receptor y S2 (stalk) para la fusi\u00f3n de membranas. La interacci\u00f3n espec\u00edfica entre S1 y el receptor desencadena un cambio conformacional en la subunidad S2, lo que lleva a la fusi\u00f3n entre la envoltura del virus y la membrana de la c\u00e9lula y la posterior liberaci\u00f3n de la nucleoc\u00e1pside en el citoplasma. El SARS-CoV-2 utiliza al receptor de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) como su receptor de entrada. Por ello esa prote\u00edna S o el dominio de uni\u00f3n al receptor es el principal objetivo de los anticuerpos neutralizantes y puede ser el principal ant\u00edgeno de desarrollo de las vacunas del SARS-CoV-2.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><strong>2.- Las nuevas vacunas de ADN y ARN<\/strong><br>Aunque las vacunas de \u00e1cidos nucleicos surgieron hace casi 30 a\u00f1os poco conoc\u00edamos de ellas hasta el surgimiento de la pandemia por beta-coronavirus y apuntan a ser uno de los grandes \u00e9xitos en la vacunaci\u00f3n mundial. Los primeros abordajes se realizaron usando ADN desnudo en forma de pl\u00e1smidos o asociado a nanopart\u00edculas de oro. Estas vacunas de ADN consisten en genes que codifican ant\u00edgenos insertados en un pl\u00e1smido bacteriano bajo el control de un promotor eucariota. El pl\u00e1smido es internalizado por las c\u00e9lulas del hospedador, donde se transcribe en el n\u00facleo y es traducido en el citoplasma por la maquinaria de la c\u00e9lula. Las prote\u00ednas resultantes se procesan en p\u00e9ptidos, que finalmente se presentan en la superficie de las c\u00e9lulas presentadoras de ant\u00edgeno (APC) en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC).<br>Alternativamente, las vacunas de ARN involucran ARN mensajero (ARNm) sintetizado en el laboratorio por transcripci\u00f3n in vitro (IVT) utilizando polimerasas de bacteri\u00f3fago sobre un ADN molde que codifica el o los ant\u00edgenos de inter\u00e9s. <\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"981\" height=\"472\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Yi-C-Virologica-Sinica-2020-1.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-568\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Yi-C-Virologica-Sinica-2020-1.png 981w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Yi-C-Virologica-Sinica-2020-1-300x144.png 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Yi-C-Virologica-Sinica-2020-1-768x370.png 768w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Yi-C-Virologica-Sinica-2020-1-600x289.png 600w\" sizes=\"auto, (max-width: 981px) 100vw, 981px\" \/><figcaption>Yi C, Virologica Sinica 2020<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Una vez administrado e internalizado por las c\u00e9lulas hu\u00e9sped, el ARN se traducen directamente en el citoplasma por la propia c\u00e9lula y luego, como en las vacunas de ADN, los ant\u00edgenos resultantes son presentado por las APC para estimular una respuesta inmunitaria. Otras ventajas del ARNm frente al ADN es que el ARNm es la cantidad m\u00ednima de informaci\u00f3n gen\u00e9tica necesaria para generar la prote\u00edna de inter\u00e9s en la c\u00e9lula y que adem\u00e1s el ARNm de cadena simple no interacciona con el genoma bicatenario, no produce recombinaciones con el ADN y no hay maquinaria celular para su duplicaci\u00f3n intracelular (con algunas excepciones que veremos luego). Adem\u00e1s, el ARN no puede integrarse en el genoma y por lo tanto no tiene potencial oncog\u00e9nico. As\u00ed, este ARNm queda patente que es meramente transitorio aumentando su seguridad y eficacia.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">A pesar de las caracter\u00edsticas prometedoras de las vacunas de ADN, se ha visto que provocan menos inmunidad que otros tipos de vacunas, incluida las vacunas de ARNm. Una posible explicaci\u00f3n ser\u00eda la necesidad de que el ADN tenga que cruzar dos membranas celulares, la nuclear y la plasm\u00e1tica. A diferencia del ADN, el ARNm solo necesita entrar en el citoplasma, donde se produce la traducci\u00f3n.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"934\" height=\"581\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Le-TK-Trends-Biochem-Sci-2020_2.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-546\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Le-TK-Trends-Biochem-Sci-2020_2.png 934w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Le-TK-Trends-Biochem-Sci-2020_2-300x187.png 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Le-TK-Trends-Biochem-Sci-2020_2-768x478.png 768w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Le-TK-Trends-Biochem-Sci-2020_2-600x373.png 600w\" sizes=\"auto, (max-width: 934px) 100vw, 934px\" \/><figcaption>Le TK, Trends Biochem Sci 2020<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Otro aspecto muy relevante es que el ARN puede actuar como un adyuvante al proporcionar se\u00f1ales coestimuladoras. Sabemos que, para ser eficientes, las vacunas deben contener un potente adyuvante que suministre una se\u00f1al de peligro para el inicio de la respuesta inmunitaria. Las propiedades inmunoestimuladoras del ARNm fueron descubiertas por la observaci\u00f3n de la inducci\u00f3n de interfer\u00f3n tras la exposici\u00f3n de las c\u00e9lulas a ARNm ex\u00f3geno extra\u00eddo de virus. Sin embargo, los efectos secundarios graves de estos adyuvantes pronto limitaron su uso. M\u00e1s tarde, en el a\u00f1o 2004, se demostr\u00f3 que el ARNm transcrito in vitro sirve como un adyuvante. Los ARN mono y bicatenarios son reconocidos por los receptores tipo toll TLR3, TLR7 y TLR8 en el endosoma. Sin embargo, TLR3 no es s\u00f3lo activada por ARN bicatenario, un intermediario para muchos virus, sino tambi\u00e9n por el ARNm liberado de las c\u00e9lulas o producido por transcripci\u00f3n in vitro. Otros receptores de reconocimiento de patrones pueden ser importantes para la funcionalidad de un adyuvante (y vacuna) basado en ARN. La helicasa citos\u00f3lica RIG-I reconoce mol\u00e9culas de ARN simple.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><strong>3.- Ventajas de vacunas de \u00e1cidos nucleicos<\/strong><br>Existen diversas razones que hacen que las vacunas de \u00e1cidos nucleicos sean tan interesantes a la hora de vacunar no s\u00f3lo contra agentes infecciosos sino a ant\u00edgenos tumorales. <\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"780\" height=\"659\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Zeng-2020.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-566\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Zeng-2020.png 780w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Zeng-2020-300x253.png 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Zeng-2020-768x649.png 768w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Zeng-2020-600x507.png 600w\" sizes=\"auto, (max-width: 780px) 100vw, 780px\" \/><figcaption>Zeng 2020<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Desde el punto de vista de su producci\u00f3n:<\/p>\n\n\n\n<ul class=\"wp-block-list\"><li>Los \u00e1cidos nucleicos son m\u00e1s simples de generar que las prote\u00ednas, p\u00e9ptidos, c\u00e9lulas o microorganismos atenuados o muertos.<\/li><li>Su administraci\u00f3n parece segura en cualquier colectivo, como, por ejemplo, inmunodeficientes.<\/li><li>Es la propia maquinaria celular del hospedador la que producir\u00e1 las prote\u00ednas inmunog\u00e9nicas.<\/li><li>Las vacunas de \u00e1cido nucleico permitir\u00edan la administraci\u00f3n de varias secuencias que codificaran para m\u00faltiples ant\u00edgenos.<\/li><li>Al hacer que el cuerpo humano produzca las prote\u00ednas virales, las vacunas de ARNm eliminan parte del proceso de fabricaci\u00f3n y deber\u00eda ser m\u00e1s f\u00e1cil y r\u00e1pido de producir que las vacunas tradicionales.<\/li><\/ul>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Y desde el punto de vista inmunol\u00f3gico:<\/p>\n\n\n\n<ul class=\"wp-block-list\"><li>Las vacunas basadas en \u00e1cidos nucleicos simulan una infecci\u00f3n o inmunizaci\u00f3n con microorganismos vivos, que son las m\u00e1s eficientes a la hora de generar inmunidad.<\/li><li>A diferencia de otras formas m\u00e1s complejas de administrar \u00e1cidos nucleicos como las encapsuladas en vectores virales, no son susceptibles de ser neutralizadas por anticuerpos y que podr\u00edan disminuir su eficacia.<\/li><li>Al ser absolutamente simples y no necesitar recubrimientos proteicos, la respuesta inmune ser\u00e1 absolutamente pura contra el potencial inmun\u00f3geno sin interferencia con otros posibles epitopos inmunodominantes que pudieran existir en otro tipo de nanopart\u00edculas o microorganismos completos.<\/li><li>Con la de ARNm no estamos introduciendo todo el virus por lo que el microorganismo no puede montar su propia autodefensa y, por lo tanto, el sistema inmunitario puede concentrarse en crear una respuesta a las prote\u00ednas virales sin interferencia del virus.<\/li><li>Contrariamente a lo que sucede con las vacunas de p\u00e9ptidos, las de ARNm no tienen ninguna restricci\u00f3n de haplotipos del HLA a la hora de poder presentar los ant\u00edgenos.<\/li><li>En las vacunas cl\u00e1sicas el p\u00e9ptido microbiano solo activa al sistema inmunitario adquirido e inducen tanto inmunidad humoral como celular mientras que el sistema inmunol\u00f3gico innato, necesario para el inicio de la respuesta inmunitaria, es activado inespec\u00edficamente por el adyuvante. Por el contrario, el ARNm de las nuevas vacunas es de por si un PAMP detectable por receptores que reconocen patrones (PRR) y por consiguiente tambi\u00e9n podr\u00eda activar el sistema inmunol\u00f3gico innato, pero de forma espec\u00edfica, proporcionando un nivel adicional de defensa sin necesidad de a\u00f1adir adyuvantes.<\/li><\/ul>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><strong>4.- Estructura del ARN mensajero<\/strong><br>El ARN eucari\u00f3tico est\u00e1 compuesto por cinco regiones que son cr\u00edticas no solo para portar la informaci\u00f3n codificada sino para darle estabilidad y capacidad de lectura. <\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"700\" height=\"357\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Messenger-RNA-mRNA.jpg\" alt=\"\" class=\"wp-image-550\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Messenger-RNA-mRNA.jpg 700w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Messenger-RNA-mRNA-300x153.jpg 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Messenger-RNA-mRNA-600x306.jpg 600w\" sizes=\"auto, (max-width: 700px) 100vw, 700px\" \/><figcaption>microbenotes.com<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Estas son:<br>1.- Una regi\u00f3n codificante que comienza con AUG (Met) y acaba con tres posibles codones stop (UAG, UAA, UGA). En ella est\u00e1 la informaci\u00f3n gen\u00e9tica para la s\u00edntesis de la prote\u00edna inmunog\u00e9nica para la vacunaci\u00f3n. El dise\u00f1o de esta ORF tiene que tener en cuenta el uso de codones por humanos y debido a la degeneraci\u00f3n del c\u00f3digo gen\u00e9ticos, las especies de ARN de transferencia predominantes, pues sabemos que var\u00edan significativamente entre especies.<br>2.- Dos regiones no traducidas (UTR) que flanquean en 3\u2019 y 5\u2019 la regi\u00f3n codificante. Aunque no codifican para prote\u00ednas estas regiones tienen importantes elementos reguladores de la traducci\u00f3n. Existen alternativas para mejorar la eficiencia traduccional de un gen como incorporar o sustituir las regiones UTR del gen en cuesti\u00f3n por la de los genes de las alfa y beta globinas. La adici\u00f3n de secuencias que se\u00f1alizan hacia ribosomas en el UTR tambi\u00e9n mejora la eficiencia de la traducci\u00f3n de nuestro ARNm vacunal.<br>3.- Una cabeza 5\u2019 7-metilguanosina trifosfato (m7G cap; capping). Esta parte tiene dos funciones clave tanto en la estabilidad como en la traducci\u00f3n: por un lado, protege al ARNm de la acci\u00f3n de las exonucleasas 5\u2019-3\u2019 y por otro lado es reconocida por el factor de iniciaci\u00f3n de la traducci\u00f3n eIF4E. El capping in vitro con la orientaci\u00f3n adecuada es una parte que genera muchos problemas biotecnol\u00f3gicos y de hecho actualmente se opta mayoritariamente por la adici\u00f3n de la cabeza de modo post-transcripcional. Otro m\u00e9todo para generar el capping eficiente es la modificaci\u00f3n del capping anti-reverso (ARCA) que pueden asegurar la orientaci\u00f3n correcta de la cabeza en el extremo 5\u2019, lo que produce mejores uniones a los ribosomas y m\u00e1s traducci\u00f3n.<br>4.- Una cola 3\u2019 poli(A). Regula la estabilidad y traducci\u00f3n del ARNm de forma sin\u00e9rgica al capping al interaccionar con una prote\u00edna (poly(A) binding protein, PABP) que forma un complejo con eIF4E. Existen diversas formas de a\u00f1adir esta cola poli(A), desde adicionarla a la hebra molde hasta de forma enzim\u00e1tica post-traduccionalmente mediante la poliadenilaci\u00f3n con una poli(A) polimerasa recombinante. La longitud de esta cola es un factor determinante de la eficacia de la formaci\u00f3n de los polisomas y por consiguiente la expresi\u00f3n de las prote\u00ednas. La longitud \u00f3ptima est\u00e1 entre 120 y 150 nucle\u00f3tidos.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Adem\u00e1s, hay otras alternativas complementarias para regular la inmunogenicidad de los p\u00e9ptidos generado o que estos ARNm sean m\u00e1s f\u00e1cilmente reconocidos por receptores reconocedores de patrones como RIG-I, PKR o TLR3, TLR 7 y TLR 8. As\u00ed ser\u00e1n internalizados en las c\u00e9lulas presentadoras de ant\u00edgenos para su traducci\u00f3n posterior en un contexto claramente coestimulador y activado de la inmunidad. Una de ellas es el uso de pseudouridina (\uf059) es un is\u00f3mero del nucle\u00f3sido uridina (U) muy prevalente en los ARNr, los ARNt y los snRNA y es la modificaci\u00f3n m\u00e1s abundante en el ARN celular total, lo que la convierte en el quinto nucle\u00f3tido del ARN. <\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"565\" height=\"320\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/pseudouridine.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-558\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/pseudouridine.png 565w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/pseudouridine-300x170.png 300w\" sizes=\"auto, (max-width: 565px) 100vw, 565px\" \/><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">La incorporaci\u00f3n de nucle\u00f3sidos qu\u00edmicamente modificados, como pseudouridina, 1-metilpseudouridina, 5-metilcitidina y otros en el ARNm, generalmente mejorar la traducci\u00f3n al dificultar la detecci\u00f3n de este ARNm por los receptores del sistema inmunitario innata (TLR7 y TLR8 principalmente), lo que conducir\u00eda tambi\u00e9n a su inactivaci\u00f3n.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"708\" height=\"565\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-556\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018.png 708w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018-300x239.png 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018-600x479.png 600w\" sizes=\"auto, (max-width: 708px) 100vw, 708px\" \/><figcaption>Pardi N, Nat Rev Drug Discover 2018<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Otra modificaci\u00f3n para mejorar estos ARNm viene del tipo de construcciones de ARNm. Hemos visto la estructural del ARNm no replicante (NRM) pero existe una alternativa, las construcciones de ARNm autoamplificado (SAM). Ambos tienen una estructura com\u00fan como la descrita en este apartado, pero la SAM incluye una secuencia derivada de virus de ARNm de cadena positiva (generalmente alfavirus) que inducen en la c\u00e9lula la replicaci\u00f3n de estos ARNm y por consiguiente la amplificaci\u00f3n de la capacidad de traducci\u00f3n. Este aspecto puede mejorar las vacunas de ARNm del futuro pues sabemos que la expresi\u00f3n in vivo es generalmente posible y suficiente para producir una inmunidad detectable. Sin embargo, generar una respuesta inmune efectiva y, a\u00fan m\u00e1s, logrando un efecto terap\u00e9utico por medio de ARNm puede ser m\u00e1s exigente en t\u00e9rminos de nivel de expresi\u00f3n de prote\u00ednas.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"1024\" height=\"510\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Jackson-NAC-NPJ-Vaccine-2020-1024x510.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-540\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Jackson-NAC-NPJ-Vaccine-2020-1024x510.png 1024w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Jackson-NAC-NPJ-Vaccine-2020-300x149.png 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Jackson-NAC-NPJ-Vaccine-2020-768x383.png 768w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Jackson-NAC-NPJ-Vaccine-2020-600x299.png 600w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Jackson-NAC-NPJ-Vaccine-2020.png 1138w\" sizes=\"auto, (max-width: 1024px) 100vw, 1024px\" \/><figcaption>Jackson NAC, NPJ Vaccine 2020<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><strong>5.- La administraci\u00f3n de vacunas de ARNm sin vectores virales<\/strong><br>La muestra procedente del sistema ITV contiene el transcrito de ARNm deseado dentro de una mezcla compleja que incluye nucle\u00f3tidos, oligonucle\u00f3tidos, fragmentos de transcripci\u00f3n cortos, as\u00ed como de prote\u00ednas. Estos contaminantes deben eliminarse de la muestra mediante una combinaci\u00f3n de etapas de precipitaci\u00f3n, cromatograf\u00eda y extracci\u00f3n. Cuanto m\u00e1s puro sea el ARNm obtenido mayor ser\u00e1 la eficiencia traduccional de nuestra vacuna. El uso del HPLC para purificar los ARNm es el m\u00e9todo que mejores resultados est\u00e1 dando en los modelos precl\u00ednicos.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">En el apartado anterior hemos visto la importancia de las distintas regiones del ARNm para su estabilidad y su eficiencia en la traducci\u00f3n adem\u00e1s de las peculiaridades que supone para su generaci\u00f3n los sistemas de ITV. Lugo una vez obtenido el ARNm listo para su uso como vacuna debemos administrarlo a la poblaci\u00f3n y que este sea efectivo activando a las c\u00e9lulas dendr\u00edticas. Hasta la fecha todas estas ventajas estaban asociadas tambi\u00e9n a una menor eficiencia en las inmunizaciones al estar los \u00e1cidos nucleicos poco protegidos y la dificultad intr\u00ednseca de hacerlos penetrar en la c\u00e9lula y conseguir la expresi\u00f3n de su informaci\u00f3n codificada. De hecho, una de las grandes cuestiones es entender y conseguir buenas tasas de penetraci\u00f3n en la c\u00e9lula, tras la inyecci\u00f3n intramuscular o en las mucosas.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">En principio existen dos alternativas para hacer llegar este ARNm a la c\u00e9lula diana, una usando vectores virales y otra prescindiendo de los mismos para ganar en seguridad, reducci\u00f3n de costes y escalabilidad en su producci\u00f3n. Nos vamos a centrar en estos \u00faltimos que pueden administrar ese ARNm de tres formas, a saber, desnuda, encapsulada o asociada a adyuvantes. Veamos un poco en detalle los tres.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">1.- <strong>ARNm desnudo:<\/strong> Numerosos estudios en modelos animales han confirmado que el ARNm desnudo puede transfectar c\u00e9lulas e inducir respuestas inmunitarias de anticuerpos y c\u00e9lulas T contra ant\u00edgenos espec\u00edficos. Sin embargo, a pesar de algunos resultados iniciales alentadores, las vacunas de ARNm desnudo siguen estando limitadas por la corta vida media del ARNm en el espacio extracelular al ser degradado de forma ubicua por ARNasas. Adem\u00e1s, las vacunas de ARN inducen expresi\u00f3n transitoria de prote\u00ednas, lo que limita el tiempo de eficacia del tratamiento. Hoy en d\u00eda para aumentar su eficiencia se usan diversas estrategias como:<\/p>\n\n\n\n<ul class=\"wp-block-list\"><li>Gene-gun: Para esta alternativa, nanopart\u00edculas de oro se recubren con el ARNm, que se inyectan intramuscularmente gracias a una pistola que usa helio presurizado. Este golpe brusco a los tejidos produce significativa necrosis en el lugar de inyecci\u00f3n favoreciendo la presencia de DAMPs y la inmunogenicidad de la vacuna.<\/li><li>Condensaci\u00f3n con protamina: consiste en condensar el ARNm con una prote\u00edna cati\u00f3nica peque\u00f1a y rica en arginina (protamina). Esta protamina no solo estabiliza al ARNm, sino que act\u00faa como alarmina a trav\u00e9s de su reconocimiento por TLR7 y TLR8.<br>La naturaleza monocatenaria del ARNm permite que el ARNm se pliegue en complejos secundarios y terciarios diferentes del ADN de doble hebra. Su longitud de unos cientos a varios miles de nucle\u00f3tidos distingue el ARNm de otros ARN monocatenarios como ARN antisentido o apt\u00e1meros. Y estas variables se van a asociar a la forma de entrada en la c\u00e9lula. La captaci\u00f3n de ARNm desnudo es un fen\u00f3meno generalizado<br>En cultivos primarios y l\u00edneas celulares de diversos tipos. La mayor parte del ARNm entra en las c\u00e9lulas a trav\u00e9s de caveolas y balsas lip\u00eddicas, muy probablemente mediadas por receptor. En menor grado, la macropinocitosis tambi\u00e9n parece estar involucrada en la captaci\u00f3n de ARNm de c\u00e9lulas en cultivo y por c\u00e9lulas dendr\u00edticas tras inyecci\u00f3n intraganglionar. Parad\u00f3jicamente, la captaci\u00f3n y expresi\u00f3n de ARNm in vivo es bastante m\u00e1s eficiente que la captaci\u00f3n espont\u00e1nea por c\u00e9lulas in vitro y comparable incluso con c\u00e9lulas transfectadas in vitro. En parte, la presi\u00f3n hidrodin\u00e1mica podr\u00eda contribuir a transfecci\u00f3n de c\u00e9lulas diana en caso de inyecciones por v\u00eda local.<\/li><\/ul>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">2.- <strong>Uso de adyuvantes:<\/strong> Adem\u00e1s de la inmunogenicidad que ocasionan los dos m\u00e9todos anteriores, esta se puede incrementar con otros PAMPs y DAMPs para potenciar la capacidad de activaci\u00f3n de las c\u00e9lulas dendr\u00edticas. Entre los adyuvantes m\u00e1s usados en estos casos tenemos poly I:C y secuencias CpG. De forma m\u00e1s sofisticada se est\u00e1 trabajando tambi\u00e9n en inyectar c\u00f3cteles de ARNm que no solo tuvieran los ant\u00edgenos de inter\u00e9s sino secuencias que codifican para mol\u00e9culas coestimuladoras de la c\u00e9lula dendr\u00edtica y que aumenten su expresi\u00f3n como CD40L, CD70, OX40L, GITR, o CD83.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">3.- <strong>Encapsulaci\u00f3n del ARNm<\/strong>: para aumentar su estabilidad y facilitar la penetraci\u00f3n del ARNm en la c\u00e9lula se pueden usar liposomas cati\u00f3nicos. Las formulaciones de nanopart\u00edculas lip\u00eddicas (LNP) son actualmente la modalidad m\u00e1s prometedora pues sirven para m\u00faltiples prop\u00f3sitos. Adem\u00e1s de la estabilidad del ARNm gracias a la protecci\u00f3n contra la degradaci\u00f3n por nucleasas, tambi\u00e9n facilitan la especificidad del \u00f3rgano, la captaci\u00f3n celular eficiente y proporcionan propiedades de escape endosomal (que lo degradar\u00eda) y que mejora dram\u00e1ticamente la aparici\u00f3n exitosa de la carga de ARNm al citoplasma de la c\u00e9lula.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"937\" height=\"355\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Le-TK-Trends-Biochem-Sci-2020_1.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-542\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Le-TK-Trends-Biochem-Sci-2020_1.png 937w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Le-TK-Trends-Biochem-Sci-2020_1-300x114.png 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Le-TK-Trends-Biochem-Sci-2020_1-768x291.png 768w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Le-TK-Trends-Biochem-Sci-2020_1-600x227.png 600w\" sizes=\"auto, (max-width: 937px) 100vw, 937px\" \/><figcaption>Le TK, Trends Biochem Sci 2020<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Una de las barreras clave que afecta la eficacia de la transfecci\u00f3n general es la degradaci\u00f3n endosomal de los LNP de ARNm. Por ello se est\u00e1 haciendo un gran esfuerzo en investigaci\u00f3n para modificar y optimizar la transici\u00f3n de la carga de ARNm del endosoma al citosol. Al parecer, el mecanismo que est\u00e1 detr\u00e1s de la liberaci\u00f3n endos\u00f3mica de ARNm depender\u00eda de la mezcla de los l\u00edpidos cati\u00f3nicos de los LNP y los fosfol\u00edpidos ani\u00f3nicos de la membrana endos\u00f3mica. <\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"812\" height=\"528\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_3.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-562\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_3.png 812w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_3-300x195.png 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_3-768x499.png 768w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_3-600x390.png 600w\" sizes=\"auto, (max-width: 812px) 100vw, 812px\" \/><figcaption>Verbeke R, Nano today 2019<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">La formaci\u00f3n de pares de iones entre estos l\u00edpidos desencadenar\u00eda una fusi\u00f3n de la membrana y la desestabilizaci\u00f3n de la membrana, lo que a su vez mejora el escape de mol\u00e9culas de ARNm de los endosomas.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"943\" height=\"301\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018_2.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-552\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018_2.png 943w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018_2-300x96.png 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018_2-768x245.png 768w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018_2-600x192.png 600w\" sizes=\"auto, (max-width: 943px) 100vw, 943px\" \/><figcaption>Pardi N, Nat Rev Drug Discover 2018<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Adem\u00e1s, importante tener en cuenta la vacuna genera productos codificados por ARNm, por lo que son degradados por proteasomas y se presentan en el MHC de clase I a las c\u00e9lulas T citot\u00f3xicas CD8+ y no alcanzan el MHC de clase II, que ser\u00eda necesario para inducir respuestas de linfocitos helper T CD4+. La adici\u00f3n de una se\u00f1al de direcci\u00f3n lisos\u00f3mica a la secuencia que codifica el ant\u00edgeno puede resultar en una respuesta productiva de c\u00e9lulas T helper.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"834\" height=\"773\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_2.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-544\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_2.png 834w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_2-300x278.png 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_2-768x712.png 768w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_2-600x556.png 600w\" sizes=\"auto, (max-width: 834px) 100vw, 834px\" \/><figcaption>Verbeke R, Nano today 2019<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Otro de los aspectos a tener en cuenta es el tipo de celular que va a captar el \u00e1cido nucleico para inducir una respuesta inmune. Parece obvio que los miocitos del m\u00fasculo no ser\u00edan las mejores c\u00e9lulas para expresar esos \u00e1cidos nucleicos y ser\u00eda recomendable que lo hicieran las c\u00e9lulas presentadoras de ant\u00edgenos, especialmente las c\u00e9lulas dendr\u00edticas. Al parecer el da\u00f1o tisular asociado a la inyecci\u00f3n de la vacuna ser\u00eda el detonante para la aparici\u00f3n del las alarminas o DAMPs requeridos no solo para captar el \u00e1cido nucleico sino para que la c\u00e9lula dendr\u00edtica empezara a expresar todo el conjunto de mol\u00e9culas de coestimulaci\u00f3n asociadas a la presentaci\u00f3n de ant\u00edgenos.<\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"711\" height=\"700\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018_3.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-554\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018_3.png 711w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018_3-300x295.png 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Pardi-N-Nat-Rev-Drug-Discover-2018_3-600x591.png 600w\" sizes=\"auto, (max-width: 711px) 100vw, 711px\" \/><figcaption>Pardi N, Nat Rev Drug Discover 2018<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><strong>6.- Efectos secundarios y estabilidad y limitaciones de las vacunas de ARNm<\/strong><br>Los principales desaf\u00edos de las vacunas de ARNm en aplicaciones cl\u00ednicas incluyen su administraci\u00f3n in vivo segura y eficiente y su distribuci\u00f3n mundial.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">La mayor parte de la investigaci\u00f3n y ensayo cl\u00ednico sobre el uso de ARNm para provocar una respuesta inmunitaria hasta ahora se ha centrado en c\u00e1ncer, para atacar a las prote\u00ednas producidas espec\u00edficamente por los tumores. Sabemos que el uso de ARNm tumoral activa muy eficientemente a las c\u00e9lulas T citot\u00f3xicas y que \u00e9stas son las m\u00e1s \u00fatil para destruir tumores. En el caso de los virus, sin duda estos linfocitos T ser\u00e1n tambi\u00e9n importante para destruir las c\u00e9lulas propias infectadas por el SARS-CoV-2, pero para combatirlo de forma m\u00e1s eficaz, ser\u00e1 necesario activar las c\u00e9lulas B y que produzcan anticuerpos neutralizantes. <\/p>\n\n\n\n<figure class=\"wp-block-image size-large\"><img loading=\"lazy\" decoding=\"async\" width=\"1024\" height=\"462\" src=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_1-1024x462.png\" alt=\"\" class=\"wp-image-560\" srcset=\"https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_1-1024x462.png 1024w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_1-300x135.png 300w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_1-768x347.png 768w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_1-600x271.png 600w, https:\/\/inmunoensayos.blogs.upv.es\/wp-content\/uploads\/2020\/12\/Verbeke-R-Nano-today-2019_1.png 1234w\" sizes=\"auto, (max-width: 1024px) 100vw, 1024px\" \/><figcaption>Verbeke R, Nano today 2019<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">En estos momentos hay poca experiencia en este aspecto y comprender si estas vacunas realmente podr\u00e1n montar una respuesta inmunitaria suficientemente protectora en el ser humano ser\u00e1 de vital importancia. As\u00ed mismo, otras cuestiones pendientes del desarrollo las iremos vislumbrando a medida que se produzcan las vacunaciones masivas que se est\u00e1n organizando en el mundo entero, como son: determinar qu\u00e9 cantidades de ARNm se necesitar\u00e1n para lograr la inmunidad; si las prote\u00ednas que se han elegido para la vacunas son las adecuadas para prevenir una infecci\u00f3n por coronavirus; cu\u00e1nto tiempo durar\u00e1 cada tipo de inmunidad; si causa efectos secundarios; o si, en el peor de los casos, se agrava la enfermedad.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Como la mayor\u00eda de las mol\u00e9culas de ARNm son susceptibles de ser degradadas por las nucleasas y exhiben una escasa captaci\u00f3n celular e inmunogenicidad, como hemos visto, estas requieren amplias modificaciones qu\u00edmicas para mejorar la estabilidad y biodisponibilidad del f\u00e1rmaco. Por ejemplo, las modificaciones de la ribosa como las metilaciones (2\u2032-O-metil) pueden mejorar significativamente la resistencia a las nucleasas y reducir las respuestas inmunitarias innatas. Pero estas modificaciones pueden estar asociadas a efectos secundarios potenciales tambi\u00e9n. Por ejemplo, est\u00e1s metilaciones podr\u00edan estar asociadas a riesgos de trombocitopenia en algunos sujetos. Tambi\u00e9n pueden causar otras toxicidades no deseadas como la inhibici\u00f3n de ACE2, o por otro lado podr\u00edan comportarse como proinflamatorios y aumentar la mortalidad en COVID-19.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">Y para terminar, el otro punto determinante es la poca estabilidad de las vacunas da ARNm que obliga a tenerlas que almacenar hasta su uso a muy bajas temperaturas, en concreto -70\u00baC para la de Pfizer y -20\u00baC para la de Moderna. Sin ninguna duda este aspecto log\u00edstico va a dificultar su uso masivo de forma global pues no todos los pa\u00edses son capaces de garantizar estas condiciones tan exigentes.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">En definitiva, tenemos una forma completamente de abordar la vacunaci\u00f3n convierte a nuestras propias en factor\u00edas que generan las mol\u00e9culas inmunog\u00e9nicas del virus. Un sistema que se basa en el uso del ARNm mejorado para ganar estabilidad y penetraci\u00f3n en la c\u00e9lula, que se expresa de forma transitoria en las mismas y sin capacidad de integrarse en el genoma, por lo que las hace seguras y eficaces. Un sistema revolucionario y seguro al que solo le queda despejar ciertas inc\u00f3gnitas sobre su eficacia como el tipo de inmunidad que podr\u00e1 generar y de la duraci\u00f3n de la misma.<\/p>\n\n\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\"><strong>7.- Referencias<\/strong><\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">1. Yang J, Arya S, Lung P, Lin Q, Huang J, Li Q. Hybrid nanovaccine for the co-delivery of the mRNA antigen and adjuvant. Nanoscale [Internet]. 2019;11(45):21782\u20139. Available from: http:\/\/dx.doi.org\/10.1039\/c9nr05475h<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">2. Zhang C, Maruggi G, Shan H, Li J. Advances in mRNA vaccines for infectious diseases. Front Immunol. 2019;10(MAR):1\u201313.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">3. Zeng C, Zhang C, Walker PG, Dong Y. Formulation and Delivery Technologies for mRNA Vaccines. 2020;<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">4. Yi C, Yi Y, Li J. mRNA Vaccines: Possible Tools to Combat SARS-CoV-2. Virol Sin. 2020;35(3):259\u201362.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">5. Verbeke R, Lentacker I, De Smedt SC, Dewitte H. Three decades of messenger RNA vaccine development. Nano Today. 2019;28.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">6. Schlake T, Thess A, Fotin-mleczek M, Kallen K. Developing mRNA-vaccine technologies. 2012;(November):1319\u201330.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">7. Restifo NP, Ying H, Hwang L, Leitner WW. The promise of nucleic acid vaccines. Gene Ther. 2000;7(2):89\u201392.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">8. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA vaccines-a new era in vaccinology. Nat Rev Drug Discov [Internet]. 2018;17(4):261\u201379. Available from: http:\/\/dx.doi.org\/10.1038\/nrd.2017.243<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">9. McNamara MA, Nair SK, Holl EK. RNA-Based Vaccines in Cancer Immunotherapy. J Immunol Res. 2015;2015.<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">10. Liu MA. A comparison of plasmid DNA and mRNA as vaccine technologies. Vaccines. 2019;7(2).<\/p>\n\n\n\n<p class=\"wp-block-paragraph\">11. Le TK, Paris C, Khan KS, Robson F, Ng W-L, Rocchi P. Nucleic acid-based technologies targeting coronaviruses. Trends Biochem Sci [Internet]. 2020;1\u201315. 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